Regjistri i Objekteve

Bibliografi

Lloji i Aplikimit

EPO patents

Nënlloji i Aplikimit

EPO Patent

(10) Numri dhe Data e Regjistrimit

6572 2017.06.16

Status

Regjistruar

(180) Data e mbarimit të afatit

2031.07.22

(20) Numri dhe Data e Depozitimit

AL/P/2017/100 2017.02.16

(40) Numri dhe Data e Publikimit

2017.08.23

(86) Data dhe Numri Ndërkombëtar i Depozitimit

11751689.8 2011.07.22

Status

Regjistruar

Data dhe Numri Ndërkombëtar i Publikimit

EP2595650 2016.11.16

(30) Detajet e Prioritetit

Kodi	ID e prioritetit
US	366714

(51) Klasat e KNP-së (IPC)

(71/73) Aplikanti

Aplikanti	Adresa
BioMarin Pharmaceutical Inc.	105 Digital Drive, Novato, CA 94949

(72) Shpikës

Emri	Adresa
KOPPAKA, Vish	10 Professional Center Parkway 10, San Rafael, CA 94903 , US
VELLARD, Michel, Claude	191 Oak Drive, San Rafael, CA 94901 , US
OKHAMAFE, Augustus, O.	5310 Crystyl Ranch Drive, Concord, CA 94521 , US
ARAYA, Kidisti	2398 Parker Street Apt. 13, Berkeley, CA 94704 , US

(74) Emri i Përfaqësuesit

Emri	Adresa
Krenar Loloçi	Rr. Deshmoret e 4 Shkurtit, Pall.1/1, Kati 2, Tiranë , AL
Krenar Loloçi	Rr. Deshmoret e 4 Shkurtit, Pall.1/1, Kati 2, Tiranë , AL

(54) Titull

METODË E PRODHIMIT TË N-ACETILGALAKOSAMIN-6-SULFATAZË SË TEPËRMI E FOSFORILUAR AKTIVE NJERËZORE DHE PËRDORIMI I SAJ

(57) Abstrakt

(58) Pretendime

Pretendim	Përshkrim
1	Metodë purifikimi të një enzime N-acetilgalaktosamine-6-sulfatase (GALNS) njerëzore e rikombinuar, kjo enzimë GALNS përmban një sekuencë acidesh të aminuara identike deri në të paktën 95 % në acidet e aminuara 27 deri 522 të SEQ ID n° : 4, në të cilën kjo enzime GALNS : Ka një pastërti të paktën 95 % të tillë që është përcaktuar me anë të ngjyrosjes në blu e Coomassie kur ajo i nënshtrohet një SDS-PAGE në kushte jo të reduktuara, Ka një përqindje konvertimi me të paktën 50 % të mbetjes së cisteinës në pozicionin 53 në Cα-formilglicine (FGly) dhe Ka ndërmjet 0,5 deri 0,8 zinxhir oligomanozë bisforforile me zinxhir proteine monomere, Dhe në të cilën të paktën 98 % të kësaj enzime GALNS të jetë në formën e prekursorit si e përcaktuar nga elektroforeza kapilare në xhel në prani të dodecilsulfatit të sodiumit (SDS-CGE), që përmban: a) filtrimin në një mjedis kulture që përmban enzimën GALNS të sekretuara duke filluar nga një linjë qelizash gjitari që shprehin faktorin e modifikimit q të sulfatazeve (SUMF1) humane dhe enzimën GALNS humane të rikombinuara, ultrafiltrimi/diafiltrimi i mjedisit të kulturës së filtruar, nëpërmjet të cilës mjedisi i kulturës së ultrafiltruar/diafiltruar është përqëndruar rreh 20 herë dhe filtrimi mbi karbon të mjedisit të kulturës së ultrafiltruar/diafiltruar 20 herë e përqëndruar; b) ngarkimin e mjedisit të kulturës së ultrafiltruar/diafiltruar 20 herë të filtruar mbi karbon që vijnë nga etapa a) në një kolonë kapjeje që përmban Sefarozë FF që çliron Zn, larja e kolonës në kushte si enzima GALNS të jetë mbajtur në kolonë dhe shpëlarja e enizmës GALNS jashtë kolonës; c) filtrimin e shpëlarjes që vjen nga kolona e kapjes që përmban Sefarozë FF që çliron Zn në etapën b) në një filtër për të hequr virusin; d) axhustimin e pH të shpëlarjes që vjen nga filtrati i kolonës së kapjes që përmban Sefarozë FF që çliron Zn që vjen nga etapa c) me një pH rreth 4,5 ± 0,1 dhe filtrimi i shpëlarjes që vjen nga filtrati i kolonës së kapjes përmban Sefarozë FF që çliron Zn të axhustuar me pH 4,5 ; e) ngarkimine filtratit që vjen nga kolona e kapjes FF që çliron Zn e axhustuar me një pH 4,5 që vjen nga etapa d) mbi një kolonë shkëmbimi të kationeve Fractogel EMD SE Hi-Cap, larja e kolonës në kushte të tilla që enzima GALNS është mbajtur mbi kolonë dhe shpëlarja e enzimës GALNS jashtë kolonës; f) axhustimin e pH të shpëlarjes së kolonës së shkëmbimit të kationeve Fractogel EMD SE Hi-Cap që vjen nga etapa e) me një pH rreth 3,5 ± 0,1 për inaktivizimin viral; g) axhustimin e shpëlarjes që ka pësuar një inaktivizim viral me pH 3,5 që vjen nga etapa f) me një pH rreth 5,0, më pas ngarkimin e shpëlarjes që ka pësuar një inaktivizim viral me 5,0 mbi një kolonë lustrimi ToyoPearl Butyl 650 M, larja e kolonës në kushte të tilla që enzima GALNS është mbajtur mbi kolonën e enzimës GALNS jashtë kolonës; h) këmbimin e tamponit të shpëlarjes që vjen nga kolona e lustrimit ToyoPearl Butyl 650 M që vjen nga etapa g) në një formulim që përmban 20 mM të NaOAc/HOAc, 50 mM të NaH2PO4, 30 mM të argininës HCl, 2 % (p/v) të sorbitolit, pH 5,4 dhe axhustimin e përqëndrimit të enzimës GALNS në formulimin me rreth 3 mg/ml ; i) eliminimin e çdo virusi dhe/ose ADN reziduale me anë filtrimi të formulimit ku tamponi është ndërruar në etapën h) me një filtër DV20 dhe një fitlër Mustang Q; dhe j) shtimin e polisorbatit 20 (PS20) në formulimin e etapës i) në një përqëndrim final prej 0,01 % (p/v).
2	Përdorimi i formulimit sipas nëj prej pretendimeve 3-12 që përmban një enzimë N-acétilgalaktosamine-6-sulfatazë (GALNS) njerëzor të rikombinuar të pastruar në prodhimin e barit për trajtimin e një subjekti që vuan nga mukopolisakaridoza e tipit IVa (MPS IVa) ose sindromi Morquio A.
3	Formulim që përmban (a) një enzimë N-acétilgalaktosamine-6-sulfatazë (GALNS) njerëzore e rikombinuar e pastruar sipas pretendimit 1, kjo enzimë GALNS që përmban një sekuencë acidesh të aminuara identike në një sasi jo më të vogël se 95 % të acideve të aminuara 27 deri 522 të SEQ ID n° : 4 dhe që ka një pastërti prej të paktën 95 % ashtu siç është përcaktuar nga ngjyrosja me blu e Coomassie kur i nënshtrohet një SDS-PAGE në kushte jo të reduktuara, që ka një përqindje konvertimit prej të paktën 50 % të mbetjes cisteinë në pozicionin 53 në Cα-formilglicine (FGly) dhe që ka ndërmjet 0,5 dhe 0,8 zinxhir oligomanozë bisforforiluara me zinxhir proteinash monomere, prej të paktën 98 % të kësaj enzime GALNS që është në formën e prekursorit siç është përcaktuar nga SDS-CGE dhe (b) një ose më shumë vektorë, diluentë ose eksipientë farmaceutikisht të pranueshme, që përmban: (i) një sasi tamponi fosfat që efektshëm për të reduktuar defosforilimin e kësaj enzime GALNS, ky tampon fosfate të jetë NaH2PO4 me një përqëndrim me rreth 25 mM deri 75 mM; dhe (ii) një sasi stabilizuese të përbërësve vijues: një kripë arginine ose një tampon, eventualisht klorhidrat arginine, kripa e argininës ose tamponin që është një përqëndrim prej 10 mM deri 50 mM; një polisorbat, eventualisht polysorbat 20; dhe një alkool sheqeri trihidrik ose më shumë, eventualisht sorbitol; Ky formulim që është një pH rreth 5,0-5,8.
4	Formulimi sipas pretendimit 3, formulim që përmban gjithashtu një tampon të dytë, eventualisht tampon acetat.
5	Formulim sipas pretendimit 3, në të cilin enzima GALNS të jetë e pastër në një sasi prej të paktën 95 % si e përcaktuar nga RP-HPLC.
6	Formulimi sipas pretendimit, në të cilën rreth 50 % deri 80 % të enzimës GALNS lidhet me një kolonë të receptorit të manozë-6-fosfat.
7	Formulimi sipa pretendimit 3, në të cilën enzima GALNS paraqet një përthithje specifike (Kabsorption) në fibroplaste që është nga 1 në 5 nM, në mënyrë të preferueshme nga 1 në 3,5 nM.
8	Formulimi sipas pretendimit 3, në të cilën përqëndrimi i enzimës GALNS është rreth 0,5 deri në 1,5 mg/ml.
9	Formulimi sipas pretendimit 4, në të cilën agjentët tamponë janë NaOAc/HOAc dhe NaH2PO4.
10	Formulimi sipas pretendimit 9, në të cilën përqëndrimi të NaOAc/HOAc të jetë rreth 10 deri 30 mM dhe përqëndrimi i NaH2PO4 është rreth 25 deri 75 mM.
11	Formulimi sipas pretendimit 3, në të cilën stabilizuesit janë arginina HCl, polisorbati 20 dhe sorbitoli.
12	Formulimi sipas pretendimit 11, në të cilën përqëndrimi i argininës HCl të jetë rreth 10 dero 50 mM, përqëndrimi i polisorbatit 20 është rreth 0,005 % deri 0,015 % (p/v) dhe përqëndrimi i sorbitolit është rreth 1,0 % deri 3,0 % (p/v).
13	Formulaimi që përmban (a) një enzimë N-acetilgalaktosamine-6-sulfatazë (GALNS) njerëzore e rikombinuar e pastruar sipas pretendimit 1, kjo enzimë GALNS që përmban një sekuencë acide të aminuara identike në sasinë prej jo më pak se 95 % të acideve të aminuara 27 deri 522 të SEQ ID n° : 4 dhe që ka një pastërti prej 95 % siç është e përcaktuar nga ngjyrosja në blu e Coomassie kur është e nënshtruar ndaj një SDS-PAGE në kushte jo të reduktuara, që ka një sasi konvertimi prej të paktën 50 % të mbetjes së cisteinës në pozicionin 53 në Cα-formilglicin (FGly) dhe që ndërmjet 0,5 dhe 0,8 zinxhir oligomanozë bisforforiluara me zinxhir proteine monomere, prej të paktën 98 % të kësaj enzime GALNS që ka një formë prekursori siç është përcaktuar nga ngjyrosja në blu e Coomassie kur i nënshtrohet një SDS-PAGE në kushte të reduktuara dhe (b) një ose më shumë vektorë, diluentë ose eksipientë farmaceutikisht të pranueshëm, që përmban: (i) NaOAc/HOAc dhe NaH2PO4 si agjentë tamponë, përqëndrimi i NaOAc/HOAc është rreth 20 ± 10 mM dhe përqëndrimi i NaH2PO4 të jetë rreth 50 ± 25 mM ; (ii) arginina HCl, polysorbat 20 dhe sorbitolit si stabilizues, përqëndrimi i argininës HCl është rreth 30 ± 20 mM, përqëndrimi i polisorbatit 20 që është rreth 0,01 % ± 0,005 % (p/v) dhe përqëndrimi i sorbitolit të jetë rreth 2,0 % ± 1,0 % (p/v); dhe (iii) një pH rreth 5,4 ± 0,4.
14	Formulimi sipas pretendimit 13 në të cilin vektori ose vektorët, diluentë ose eksipientë farmaceutikisht të pranueshëm janë thelbësisht të përbëra nga: (i) NaOAc/HOAc, përqëndrimi i NaOAc/HOAc të jetë rreth 20 ± 10 mM; (ii) NaH2PO4, përqëndrimi i NaH2PO4 të jetë rreth 50 ± 25 mM; dhe (iii) arginina e HCl, polisorbat 20 dhe sorbitol në formën e stabilizuesve, përqëndrimi i argininës HCl të jetë rreth 30 ± 20 mM, përqëndrimi i polysorbatit 20 të jetë rreth 0,01 % ± 0,005 % (p/v) dhe përqëndrimi i sorbitolit të jetë rreth 2,0 % ± 1,0 % (p/v).